Príloha č. 8
                                                                 k  nariadeniu vlády č...../2003 Z. z.

ANALYTICKÉ METÓDY A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV ANALÝZ ÚRADNÝCH VZORIEK

ČASŤ A
VŠEOBECNÉ POŽIADAVKY

1. Predmet a oblasť
Požiadavky tejto  prílohy sa vzťahujú na analytické metódy, ktoré sa používajú na testovanie úradných vzoriek odobratých podľa § 15 ods.1 tohto nariadenia, a opisuje všeobecné kritériá pre interpretáciu analytických výsledkov úradných kontrolných laboratórií pre tieto vzorky.
Táto príloha sa nevzťahuje na látky, pre ktoré sú  právnymi predpismi Slovenskej republiky a legislatívou Európskych spoločenstiev ustanovené podrobnejšie požiadavky.

2. Analytické metódy
Úradné vzorky odobraté podľa tohto nariadenia sa  musia analyzovať metódami, ktoré 
a)	sú dokumentované návodom testov, najlepšie podľa slovenskej technickej normy 1)
b)	vyhovujú oddielu  2.  časti B,
c)	boli validované v súlade s postupmi opísanými v oddieli 3. časti B,
d)	vyhovujú príslušnému minimu požadovaných pracovných limitov ( MRPL ), ktoré ustanovené v súlade s bodom 3.

3. Minimum požadovaných pracovných limitov
Táto príloha sa bude meniť a dopĺňať tak, aby sa postupne ustanovilo minimum požadovaných pracovných limitov ( MRPL )pre analytické metódy, ktoré sa používajú pre látky, pre ktoré nie sú ustanovené povolené limity.

4. Kontrola kvality
Kvalita výsledkov analýz vzoriek odobratých v súlade týmto nariadením sa musí zabezpečovať jednotlivo monitorovaním testov alebo výsledkov kalibrácie podľa slovenskej technickej normy 2) .

5. Interpretácia výsledkov
Výsledok analýzy sa považuje za nezhodný, ak bol prekročený rozhodujúci limit konfirmačnej metódy pre analyt.
Ak je pre látku ustanovený povolený limit, rozhodujúcim limitom je koncentrácia, nad ktorou je možné so štatistickou istotou 1 –α rozhodnúť, že je prítomný určitý analyt.
Ak nie je pre látku ustanovený žiadny povolený limit, rozhodujúci limit je najnižšia hladina koncentrácie, pri ktorej môže metóda so štatistickou istotou 1-α  , že je prítomný určitý analyt.
Pre látky uvedené v skupine A prílohy  č.2  je chyba α  1% a menej. Pre ostatné látky je chyba α 5% a menej.

ČASŤ B
PRACOVNÉ KRITÉRIÁ, INÉ POŽIADAVKY A POSTUPY ANALYTICKÝCH METÓD

1. Definície pojmov

1.1.	Správnosťou sa rozumie blízkosť zhody medzi výsledkom skúšky a uznanou referenčnou hodnotou (2).Je určená výťažnosťou a presnosťou.
1.2.	Alfa (α) chybou sa rozumie pravdepodobnosť, že testovaná vzorka je zhodná, aj keď bola získaná nezhodným meraním (falošne nezhodné rozhodnutie).
1.3.	Analytom sa rozumie látka, ktorá má byť detekovaná, identifikovaná a/alebo kvantifikovaná a deriváty, ktoré sa objavujú počas analýzy.
1.4.	Beta (β) chybou sa rozumie pravdepodobnosť, že testovaná vzorka je skutočne nezhodná, aj keď bola získaná zhodným meraním (falošne zhodné rozhodnutie).
1.5.	Bias-om sa rozumie rozdiel medzi predpokladaným výsledkom testu a uznanou referenčnou hodnotou (2).
1.6.	Kalibračným štandardom sa rozumie prostriedok na meranie, ktorý predstavuje kvantitu látky, ktorá nás zaujíma tak, že spája svoju hodnotu s referenčným základom.
1.7.	Certifikovaným referenčným materiálom ( CRM ) sa rozumie materiál, ktorý má určený presne stanovený obsah analytu.
1.8.	Co-chromatografiou sa rozumie postup, v ktorom je extrakt pred chromatografickým krokom ( krokmi ) rozdelený na dve časti. Časť jedna je chromatografovaná ako taká. Časť dva je zmiešaná so štandardným analytom na meranie. Potom je táto zmes tiež chromatografovaná. Množstvo pridaného štandardného analytu má byť rovnaké ako odhadované množstvo analytu v extrakte. Táto metóda je navrhnutá na zlepšenie identifikácie analytu pri používaní chromatografických metód, hlavne ak nemôže byť použitý vhodný interný štandard.
1.9.	Porovnávacími štúdiami sa rozumie analyzovanie rovnakej vzorky rovnakou metódou na určenie pracovných charakteristík metódy. Tieto štúdie pokrývajú náhodné chyby merania a laboratórny bias.
1.10.	Konfirmačnou metódou sa rozumejú metódy, ktoré poskytujú úplnú alebo doplňujúcu informáciu umožňujúcu látku jednoznačne identifikovať a ak je potrebné kvantifikovať na úrovni záujmu.
1.11.	Rozhodujúcim limitom ( CC α) sa rozumie limit, v a nad ktorým sa môže s chybou pravdepodobnosti α dospieť k záveru, že vzorka je nezhodná.
1.12.	Detekčnou schopnosťou ( CC β ) sa rozumie najnižší obsah látky, ktorý môže byť vo vzorke detekovaný a/alebo kvantifikovaný s chybou pravdepodobnosti β. V prípade látok, pre ktoré nebol ustanovený limit, detekčná schopnosť je najnižšia koncentrácia, pri ktorej je metóda schopná detekovať skutočne kontaminované vzorky so štatistickou istotou 1 – β. V prípade látok s ustanoveným limitom, to znamená, že detekčná schopnosť je koncentrácia, pri ktorej je metóda schopná detekovať stanovený limit so štatistickou istotou 1 – β.
1.13.	Fortifikovaným materiálom vzorky sa rozumie vzorka obohatená známym množstvom detekovaného analytu.
1.14.	Medzilaboratórnymi  porovnaniami sa rozumie organizácia, vykonanie a vyhodnotenie testov tej istej vzorky dvoma alebo viacerými laboratóriami v súlade s vopred určenými podmienkami určujúcimi skúšobný postup. Podľa zámeru štúdie môžu byť klasifikované ako collaborative study alebo skúšky spôsobilosti.
1.15.	Interným štandardom ( IS ) sa rozumie látka, ktorá nie je  neobsiahnutá vo vzorke s fyzikálno-chemickými vlastnosťami čo najpodobnejšími s vlastnosťami analytu, ktorý má byť identifikovaný a ktorá sa pridá do každej vzorky ako aj do kalibračného štandardu.
1.16.	Laboratórnou vzorkou sa rozumie vzorka pripravená na zaslanie do laboratória za účelom skúmania alebo testu.
1.17.	Úrovňou záujmu sa rozumie koncentrácia látky alebo analytu vo vzorke, ktorá je dôležitá k určeniu jej zhody s legislatívou.
1.18.	Minimom požadovaných pracovných limitov ( MRPL  ) sa rozumie najmenší obsah analytu vo vzorke, ktorý môže byť detekovaný a potvrdený.  Je určený na harmonizáciu vykonávania analytických metód u látok, pre ktoré nebol ustanovený limit.
1.19.	Pracovnými charakteristikami sa rozumie prevádzková kvalita, ktorá sa môže prisúdiť analytickej metóde. Môže to byť napríklad  špecifickosť, správnosť, výťažnosť, presnosť, opakovateľnosť, reprodukovateľnosť, výťažnosť, detekčná schopnosť a robustnosť.
1.20.	Pracovnými kritériami sa rozumejú požiadavky na pracovné kritériá, podľa ktorých je možné posúdiť, že analytická metóda je vhodná pre účel a tvorí hodnoverné výsledky.
1.21.	Stanoveným limitom sa rozumie maximálny limit rezíduí, maximálna úroveň alebo iná maximálna prípustná odchýlka ustanovená iným právnym predpisom Spoločenstva.
1.22.	Presnosťou sa rozumie  blízkosť zhody medzi nezávislými výsledkami testu získanými za stanovených ( vopred stanovených ) podmienok. Miera presnosti sa zvyčajne vyjadruje pojmami nepresnosť a vypočíta sa ako smerodajná odchýlka výsledku.  Nižšia presnosť je určená väčšou smerodajnou odchýlkou (2).
1.23.	Skúškou spôsobilosti sa rozumie analyzovanie rovnakej vzorky, ktoré dovoľuje laboratóriám vybrať si ich vlastné metódy, pod podmienkou, že tieto metódy sú použité za bežných podmienok. Skúšky sa musia realizovať podľa ISO guide 43-1 (3) a 43-2 (4) a môžu sa použiť na stanovenie reprodukovateľnosti metód0
1.24.	Kvalitatívnou metódou sa rozumie analytická metóda, ktorá identifikuje látku na základe jej chemických, biologických a fyzikálnych vlastností.
1.25.	Kvantitatívnou metódou sa rozumie analytická metóda, ktorá určuje množstvo alebo hmotnostný zlomok látky a teda môže sa vyjadriť ako numerická hodnota v príslušných jednotkách.
1.26.	Slepým pokusom sa rozumie úplný analytický postup aplikovaný bez dávky testu alebo použitím ekvivalentného množstva vhodného rozpúšťadla na miesto dávky testu.
1.27.	Výťažnosťou sa rozumie percento pravdivej koncentrácie látky získanej počas analytického postupu. Ak nie je dostupný referenčný materiál, určuje sa počas validácie.
1.28.	Referenčným materiálom sa rozumie materiál, ktorého jedna alebo viac vlastností sú potvrdené validovanou metódou a teda môže sa použiť na kalibráciu prístroja alebo na overenie metód merania.
1.29.	Opakovateľnosťou sa rozumie presnosť za opakovateľných podmienok (2).
1.30.	Opakovateľnými podmienkami sa rozumejú podmienky, keď sú nezávislé  výsledky testu získané rovnakou metódou na rovnakých skúšobných predmetoch v rovnakom laboratóriu, rovnakým operátorom, ktorý používa rovnaké vybavenie.
1.31.	Reprodukovateľnosťou sa rozumie presnosť za reprodukovateľných podmienok (2)(4).
1.32.	Reprodukovateľnými podmienkami sa rozumejú podmienky, keď sú výsledky testu získané rovnakou metódou na rovnakých skúšobných predmetoch v rôznych laboratóriách, rôznymi operátormi, ktorí  používajú rôzneho vybavenia (2)(4).
1.33.	Robustnoťou sa rozumie schopnosť analytickej metódy prijať zmeny experimentálnych podmienok, ktoré sa môžu vyjadriť ako zoznam materiálov vzorky, analytov, podmienok skladovania, prostredia a/alebo podmienok prípravy vzorky, za ktorých môže byť metóda použitá ako bolo doporučené, alebo s malými špecifikovanými modifikáciami. Pre všetky experimentálne podmienky, ktoré môžu byť v praxi predmetom výkyvu (napríklad stabilita reagentov, zloženie vzorky, pH, teplota ), majú byť označené akékoľvek odchýlky, ktoré môžu ovplyvniť analytický výsledok.
1.34.	Slepou vzorkou sa rozumie úplný analytický postup použitý v dávke testu odobratej zo vzorky, v ktorej chýba analyt.
1.35.	Screeningovou metódou sa rozumejú metódy, ktoré sa používajú na detekciu prítomnosti látky alebo skupiny látok v úrovni záujmu. Tieto metódy majú schopnosť vysokej kapacity vzoriek a používajú sa na roztriedenie veľkého počtu vzoriek na potenciálne nezhodné výsledky.
1.36.	Vnútrolaboratórnou validáciou sa rozumie analytické štúdium zahŕňajúce jediné laboratórium, ktoré používa jednu metódu k analýze rovnakých alebo rôznych skúšobných materiálov za rôznych podmienok počas dlhých časových intervalov.
1.37.	Špecifickosťou sa rozumie schopnosť metódy rozoznať meraný analyt od ostatných látok. Táto vlastnosť je rozhodujúcou funkciou opísaných techník merania, ale môže sa meniť v závislosti od skupiny zložiek alebo matrice.
1.38.	Štandardným prídavkom sa rozumie postup, pri ktorom je vzorka rozdelená do dvoch (alebo viacerých ) častí testu. Jedna časť sa analyzuje ako taká a do druhej časti sa pred analýzou pridá známe množstvo štandardného analytu. Množstvo pridaného štandardného analytu má byť dvojnásobne až päťnásobkom odhadovaného množstva analytu vo vzorke. Tento  postup je určený na determináciu obsahu analytu vo vzorke, ktorý počíta s výťažnosťou analytickej metódy.
1.39.	Štandardným analytom sa rozumie analyt o známom a certifikovanom obsahu a čistote používaný ako referenčný v analýze.
1.40.	Látkou sa rozumie hmota o presnej alebo definovanej štruktúre a jej metabolity.
1.41.	Dávkou testu sa rozumie kvantita materiálu zo vzorky testu na ktorej sa uskutočňuje test alebo pozorovanie.
1.42.	Vzorkou testu sa rozumie vzorka pripravená z laboratórnej vzorky, z ktorej sa odoberá dávka testu.
1.43.	Pravdivosťou sa rozumie blízkosť zhody medzi priemernou hodnotou získanou z veľkých sérií výsledkov testov a prijateľnou referenčnou hodnotou. Pravdivosť sa zvyčajne vyjadruje ako bias (2).
1.44.	Jednotkami sa rozumejú jednotky podľa slovenskej technickej normy3) a podľa osobitného predpisu   uvedeného v prílohe č. 9 v bode 4.
1.45.	Validáciou sa rozumie  potvrdenie vyšetrením a poskytnutie  skutočného dôkazu, že príslušné požiadavky osobitného určenia sú splnené (1).
1.46.	Vnútrolaboratórnou reprodukovateľnosťou sa rozumie presnosť získaná v tom istom laboratóriu za určených (vopred stanovených ) podmienok (vrátane napríklad metóda, materiál testu, operátor, prostredie) za dlhý časový úsek.

2.Pracovné kritériá a iné požiadavky na analytické metódy

Analytické metódy alebo kombinácie metód iné ako sú opísané nižšie sa môžu používať len na screeningové alebo konfirmačné účely ak môže byť dokázané, že sú splnené príslušné požiadavky opísané v tomto rozhodnutí.

2.1. Všeobecné požiadavky

2.1.1. Manipulácia so vzorkami   
Vzorky majú byť získavané, manipulované a spracované takým spôsobom, aby bola maximálna možnosť detekcie látky. Postupy zaobchádzania so vzorkou  majú zabrániť možnosti náhodnej kontaminácie alebo strate analytu.

2.1.2.Vykonávanie testov

2.1.2.1.Výťažnosť
Počas analýzy vzoriek má byť určená výťažnosť pre každú skupinu vzoriek, ak sa používa stály korekčný faktor. Ak je výťažnosť v medzných hodnotách, potom sa môže použiť stály korekčný faktor. V opačnom prípade sa musí použiť výťažnosti získaný pre špecifickú skupinu, ak nebude potrebné použiť špecifický faktor výťažnosti analytu vo vzorke a v tom prípade sa na kvantitatívne určenie analytu vo vzorke použije postup štandardného prídavku (pozri 3.5) alebo interný štandard.

2.1.2.2.Špecifickosť                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  
Metóda má byť schopná rozlíšiť medzi analytom a ostatnými látkami za experimentálnych podmienok. Má byť poskytnutý odhad, ku akému rozsahu to je možné. Majú sa použiť stratégie, aby sa predišlo predvídateľným interferenciám s látkami, ak sa používa opísaná technika, napríklad homológy, analógy, metabolické produkty rezídua záujmu. Je prvotne dôležité, aby bola skúmaná interferencia, ktorá môže vzísť  zo zložiek matrice.

2.2.Screeningové metódy
Na screeningové účely sa môžu používať len tie analytické metódy, u ktorých  sa môže preukázať dokumentovaným viditeľným spôsobom, že sú validované a majú falošne zhodný pomer < 5% (β-chyba )v súlade s týmto nariadením.V prípade podozrenia nezhodného výsledku, tento výsledok sa potvrdí konfirmačnou metódou.

2.3.Konfirmačné metódy pre organické rezíduá a kontaminanty

Konfirmačné metódy pre organické rezíduá a kontaminanty poskytnú informáciu o chemickej štruktúre analytu. Z toho vyplýva, že metódy založené len na chromatografickej analýze bez spektrofotometrickej detekcie nie sú vhodné ako konfirmačné metódy. Aj keď jednotlivá technicka nemá dostatočnú špecifickosť, žiadaná špecifickosť sa dosiahne analytickými postupmi pozostávajúcimi z vhodných kombinácií čistenia, chromatografickej separácie 
( separácií ) a spektrometrickou detekciou.

Nasledujúce metódy alebo kombinácie metód sa považujú za vhodné na identifikáciu rezíduí alebo kontaminantov pre uvedené skupiny látok :

Tabuľka 1
Vhodné konfirmačné metódy pre organické rezíduá alebo kontaminanty

Meracia technika	Látky prílohy 1 96/23/EC	Limitácie	
LC alebo GC s hmotnostnou spektrometrickou detekciou

LC alebo GC s IR spektrometrickou detekciou

LC-full-scan DAD

LC fluorescencia

2-D TLC-full-scan UV/VIS

GC detekcia elektrónového záchytu

LC imunogram

LC-UV/VIS (jediná vlnová dĺžka)	Skupina A a B

Skupina A a B

Skupina B

Skupina B

Skupina B

Skupina B

Skupina B

Skupina B
	Len ak nasleduje buď on-line alebo off-line chromatografická separácia
Len ak sa používajú full scan techniky alebo ak sa použijú najmenej 3 ( skupina B ) alebo 4 ( skupina a ) identifikačné body u metód, ktoré nezaznamenávajú celú hmotnostné spektrum

Musia byť splnené špecifické požiadavky na absorbciu u IR spektrometrie

Musia byť splnené špecifické požiadavky na absorbciu u UV spektrometrie

Len pre molekuly, ktoré vykazujú natívnu fluorescenciu pre molekuly, ktoré vykazujú fluorescenciu buď po transformácii alebo po derivatizácii

Dvojdimenzionálna HPTLC a co-chromatografia sú záväzné

Používajú sa len dve kolóny rôznej polarity

Len ak sa použijú najmenej dva rôzne chromatografické systémy alebo druhá, nezávislá metóda detekcie

Len ak sa použijú najmenej dva rôzne chromatografické systémy alebo druhá, nezávislá metóda detekcie	

2.3.1.Všeobecné pracovné kritériá a požiadavky

Konfirmačné metódy majú poskytovať informáciu o chemickej štruktúre analytu. Ak viac ako jedna zložka dáva rovnakú odozvu, potom metóda nedokáže rozoznať medzi týmito  zložkami. Metódy, ktoré sú založené len na chromatografickej analýze bez použitia spektrometrickej detekcie nie sú vhodné  ako konfirmačné metódy.

Kde je v metóde zaužívané, pridá sa na začiatku extrakcie k dávke testu vhodný interný štandard. V závislosti na dostupnosti, sa použijú buď stabilné izotopom značené formy analytu, ktoré sú konkrétne vhodné pre hmotnostnú spektrometrickú detekciu, alebo zložky, ktoré sú štruktúrou príbuzné analytu.

Ak sa nemôže použiť vhodný interný štandard, identifikácia analytu músí byť potvrdená co-chromatografiou. V takom prípade sa získa len jeden pík, zvýšená výška píku ( alebo plocha ) je ekvivalentná množstvu pridaného analytu. U plynovej chromatografie ( GC ) alebo kvapalinovej chromatogfrafie ( LC ) šírka píku v polovici maximálnej výšky bude v 90-110% rozsahu pôvodnej šírky a retenčný čas bude identický v rozpätí  5%. U metód  tenkovrstvovej chromatografie (TLC ) sa zosilní len škvrna, o ktorej  sa predpokladá, že ide o analyt;  nová škvrna sa neobjaví a vizuálny vzhľad sa nezmení.

Referenčné alebo fortifikované materiály obsahujúce známe množstvo analytu,  buď blízko povoleného limitu, alebo rozhodujúceho limitu (nezhodné kontrolné vzorky) ako aj zhodné kontrolné materiály a slepé pokusy majú byť, ak je to možné vykonávané počas celého postupu priebežne a s každou analyzovanou skupinou vzoriek. Postup na injikovanie extraktov do analytického prístroja je nasledovný: slepý pokus, zhodná kontrolná vzorka, vzorky na potvrdenie, znova zhodná kontrolná vzorka a nezhodná kontrolná vzorka. Každá zmena tohto postupu musí byť zdokumentovaná.

2.3.2. Dodatočné pracovné kritériá a iné požiadavky na kvantitatívne analytické metódy

2.3.2.1.Pravdivosť kvantitatívnych metód
V prípade opakovaných analýz certifikovaného referenčného materiálu direktívne rozsahy pre odchýlku experimentálne určenej výťažnosti korigované hmotnostným zlomokom z certifikovanej hodnoty, sú nasledovné

Tabuľka 2
Minimálna pravdivosť kvantitatívnych metód  

hmotnostný zlomok	Rozsah	
≤1 ug/kg

>1 ug/kg až 10 ug/kg

≥10 ug/kg	-50% až +20%

-30% až +10%

-20% až +10%	

Ak nie prístupný taký referenčný materiál, je prijateľné, že pravdivosť meraní je hodnotená cez výťažnosť dodatkov známeho množstva analytu ( analytov ) k slepej matrici. Korigované údaje s priemernou výťažnosťou sú prijateľné, len ak sú v rozsahoch uvedených v tabuľke 2.

2.3.2.2.Presnosť kvantitatívnych metód
Vnútrolaboratórny variačný koeficient (CV) pre opakované analýzy referenčného alebo fortifikovaného materiálu za reprodukovateľných podmienok, nesmie presiahnuť úroveň vypočítanú Horwitzovou rovnicou. Rovnica je 
CV=2(1-0,5log C )
kde C je hmotnostný zlomok vyjadrený ako exponent 10 ( napríklad 1mg/g = 103 ) Príklady sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3
Príklady reprodukovateľnosti CV pre kvantitatívne metódy v rozsahu hmotnostných zlomkov

hmotnostný zlomok	Reprodukovateľnosť ( CV )	
1 ug/kg

10 ug/kg

100 ug/kg

1000 ug/kg ( 1 mg/kg )
	(*)

(*)

23

16	
(*) Pre hmotnostné zlomky nižšie ako 100 ug/kg dáva Horwitzova rovnica neprijateľne vysoké hodnoty. Preto, CV pre koncentrácie nižšie ako 100 ug/kg majú byť tak nízke ako to je možné.

Pre analýzy vykonávané za opakovateľných podmienok, vnútrolaboratórny CV by mal byť typicky medzi jednou polovicou a dvoma tretinami nad hodnotami. U analýz vykonávaných za podmienok vnútrolaboratórnej opakovateľnosti , vnútrolaboratórny CV nesmie byť väčší než CV reprodukovateľnosti.
V prípade látok so stanoveným prípustným limitom, metóda musí dosiahnuť reprodukovateľnosť nie vyššiu ako korešpondujúci CV reprodukovateľnosti pri koncentrácii 0,5% povoleného limitu.

2.3.3.Pracovné kritériá a iné požiadavky na hmotnostnú spektrometrickú detekciu

Hmotnostné spektrometrické metódy sú vhodné ako konfirmačné metódy len na základe buď on-line alebo off-line chromatografickej separácie.

2.3.3.1. Chromatografická separácia
U GC-MS sa chromatografická plynová separácia vykonáva za použitia kapilárnych kolón. U LC-MS sa chromatografická plynová separácia vykonáva za použitia vhodných LC kolón. V každom prípade, minimálny prijateľný retenčný čas pre vyšetrovaný analyt je dvojnásobkom retenčného času, ktorý zodpovedá uvoľnenému obsahu z kolóny. Retenčný čas ( alebo relatívny retenčný čas ) analytu dávky testu sa má porovnať s kalibračným štandardom v špecifikovanom rozmedzí retenčného času. Rozmedzie retenčného času má zodpovedať rozlišovacej schopnosti chromatografického systému. Podiel chromatografického retenčného času analytu k retenčnému času interného štandardu,t.j. relatívny retenčný čas analytu má zodpovedať relatívnym retenčným časom kalibračného roztoku v tolerancii +-0,5% pre GC a +- 2,5% pre LC.

2.3.3.2.Hmotnostná spektrometrická detekcia

Hmotnostná spektrometrická detekcia sa vykonáva použitím MS techník ako záznam celého hmotnostného spektra ( full scans ) alebo selektívnym iónovým monitoringom ( SIM ) ako aj MS-MSn technikami ako selektívny reakčný monitoring ( SRM ) alebo inými vhodnými MS alebo MS-MSn technikami  v kombinácii s vhodnými ionizačnými spôsobmi. U hmotnostnej spektrometrie s vysokým rozlíšením ( HRMS ), má byť rozlíšenie vyššie ako 10000 pre celý  hmotnostný rozsah v 10% údolia.

Záznam celého hmotnostného spektra ( full scan ): Ak sa vykonáva hmotnostná spektrometrická determinácia záznamom celého spektra, je povinná prítomnosť všetkých meraných rozpoznávacích iónov ( molekulárny ión, charakteristický adukt molekulárneho iónu, charakteristický fragment iónov a izotopových iónov ) s relatívnou intenzitou vyššou ako 10% v referenčnom spektre kalibračného štandardu.

SIM : Ak sa vykonáva hmotnostná spektrometrická determinácia fragmentografiou, molekulárny ión bude najskôr jeden z vybraných rozpoznávacích iónov ( molekulárny ión, charakteristický adukt molekulárneho iónu, charakteristický fragment iónov a všetky ich izotopové ióny ). Vybraný rozpoznávací ión nemá pochádzať len z rovnakej časti molekuly. Pomer signálu k šumu pre každý diagnostický ión má byť ≥3:1.

Záznam celého hmotnostného spektra ( full scan ) a SIM : Relatívne intenzity detekovaných iónov, vyjadrené ako percento intenzity najintenzívnejšieho iónu alebo prechodu, má zodpovedať intenzitám z kalibračných štandard, buď zo štandardných kalibračných roztokov alebo z pridaných vzoriek, pri porovnateľných koncentráciách, meraných  za rovnakých podmienok, s nasledovnými toleranciami:

Tabuľka 4
Maximálne povolené tolerancie pre relatívne iónové intenzity použitím rozsahu spektrometrických techník

Relatívna intenzita
( % bázy píku )	EI-GC-MS
	CI-GC-MS, GC-MSn, LC-MS, LC-MSn
	
> 50%

> 20% až 50%

> 10% až 20%

≤ 10%	 10%

 15%

  20%

  50%	  20%

 25%

 30%

 50%	

Interpretácia údajov hmotnostného spektra : Relatívne intenzity rozpoznávacích iónov a/alebo prekurzorov/produktov iónových párov majú  byť identifikované porovnaním spektra alebo integrovaním signálov jednotlivých záznamoch hmoty. Vždy keď sa použije korekcia pozadia, musí sa použiť jednotne v celej skupine a musí byť jasne označená.

Záznam celého hmotnostného spektra ( full scan ): Ak sa zaznamenáva celé hmotnostné spektrum v jednotnej hmotnostnej spektrometrii, majú byť prítomné minimálne štyri ióny s relatívnou intenzitou  ≥ 10%  bázy píku. Molekulárny ión má byť zahrnutý, ak je prítomný v referenčnom spektre s relatívnou intenzitou ≥ 10%  . Najmenej štyri ióny musia ležať v maximálnych povolených toleranciách pre relatívne iónové intenzity ( tabuľka 5 ). Môže sa použiť vyhľadávací systém knižnice počítača. V tomto prípade, porovnanie údajov hmotnostného spektra testovaných vzoriek s tými z kalibračného roztoku má presiahnuť kritický porovnávací faktor. Tento faktor musí byť určený počas validačného procesu pre každý analyt na základe spektier, pre ktoré sú splnené kritériá popísané nižšie. Má byť skontrolovaná variabilita v spektre spôsobená matricou vzorky a detektor.

SIM : Ak sú hmotnostné fragmenty merané pomocou iných full-scan techník, na interpretáciu výsledkov sa použije systém identifikácie bodov. Na potvrdenie látok zo skupiny A prílohy I Smernice 96/23/EC sa požadujú minimálne štyri identifikačné body. Na potvrdenie látok zo skupiny B prílohy I Smernice 96/23/EC sa požadujú minimálne tri identifikačné body. Nižšie uvedená tabuľka ukazuje počet identifikačných bodov, ktoré môže dosiahnuť základná technika hmotnostnej spektrometrie. Avšak, aby sa stanovili identifikačné body požadované na konfirmáciu a aby sa mohla vypočítať suma identifikovaných bodov:

a)	má sa merať najmenej jeden iónový ukazovateľ,
b)	všetky relevantné iónové ukazovatele majú spĺňať vyššie uvedené kritériá,
c)	na dosiahnutie minimálneho počtu identifikačných bodov je možné kombinovať maximálne tri separátne techniky.

Tabuľka 5
Vzťah medzi rozmedzím skupín hmotnostných fragmentov a dosiahnutými identifikačnými bodmi

MS technika	identifikačné body získané na ión	
hmotnostná spektrometria s nízkym rozlíšením (LR)

LR-MSn prekurzor ión

LR-MSn prechodné produkty

HRMS

HR-MSn prekurzor ión

HR-MSn prechodné produkty	1,0

1,0

1,5

2,0

2,0

2,0	

Poznámky :
(1)	Každý ión môže byť počítaný len raz
(2)	GC-MS, ktorá  využíva elektrónovú ionizáciu nárazom sa považuje za rozdielnu techniku od GC-MS, ktorá  využíva chemickú ionizáciu.
(3)	Za účelom zvýšenia počtu identifikačných bodov sa môžu použiť rôzne analyty, len ak deriváty využívajú rôznu reakčnú chémiu.
(4)	Pre všetky látky zo skupiny A prílohy I smernice 96/23/EC, ak sa použije jeden z analytických postupov : HPLC spojená s full-scan diode array spektrometriou (DAD); HPLC spojená s fluorescenčnou detekciou; HPLC spojená s imunogramom, dvojdimenzionálna  TLC spojená so spektrometrickou detekciou; maximum z jedného identifikačného bodu môže prispieť, zabezpečuje, že sú splnené náležité kritériá.
(5)	Prechodné produkty zahŕňajú dcérske a pradcérske produkty.

Tabuľka 6
Príklady počtu identifikačných bodov získaných z rozsahu techník a ich kombinácií 
( n = celé číslo )

Technika (y)	Počet iónov	Identifikačné body	
GC-MS (EI alebo CI)

GC-MS (EI a CI)

GC-MS (EI alebo CI) 2 deriváty

LC-MS

GC- MS-MS

LC-MS-MS

GC- MS-MS

LC-MS-MS

LC-MS-MS-MS

HRMS

GC-MS a LC-MS

GC-MS a HRMS
	N

2(EI) +2(CI)

2(derivát A)+2(derivát B)

N

1 prekurzor a 2 dcérske produkty
1 prekurzor a 2 dcérske produkty
2 prekurzorové ióny, každý  má 1 dcérsky produkt
2 prekurzorové ióny, každý  má 1 dcérsky produkt 
1 prekurzor, každý  má 1 dcérsky produkt 
a 2 pradcérske produkty
N

2+2

2+1	n

4

4

n

4

4

5

5

5,5

2n

4

4	

2.3.4. Pracovné kritériá a iné požiadavky na chromatografiu spojenú s infračervenou detekciou

Adekvátne píky : Adekvátne píky sú absorbčné maximá kalibračných štandard v infračervenom spektre, ktoré spĺňajú nasledovné požiadavky.

2.3.4.1. Infračervená detekcia
Absorbčné maximum : Má byť vo vlnočte v pásme 4000-500 cm-1.
Intenzita absorbcie : Nemá byť menej ako buď :
a)	špecifická molárna absorbcia 40 so zreteľom na základnú líniu píku alebo
b)	relatívna absorbancia 12,5% z absorbancie najintenzívnejšieho píku v oblasti 4000-500 cm-1,
 ak sú merané obidva so zreteľom na nulovú absorbanciu a 5% absorbancie najintenzívnejšieho píku v  oblasti 4000-500 cm-1, ak sú merané obidva so zreteľom na základnú líniu píku.

Poznámka:
Aj keď adekvátne píky podľa písmena a) majú mať prednosť pred teoretickým aspektom, píky podľa písmena b) sú jednoduchšie determinovateľné v praxi.

Počet píkov v infračervenom spektre u analytov, ktorých frekvencie korešpondujú s adekvátnym píkom spektra kalibračného štandardu sa určuje v rozpätí 1 cm-1.

2..3.4.2. Interpretácia údajov infračerveného spektra

Absorbcia má byť prítomná vo všetkých oblastiach spektra analytu, ktoré korešponduje s adekvátnym píkom v referenčnom spektre kalibračného štandardu. Požaduje sa minimálne šesť adekvátnych píkov v infračervenom spektre kalibračného štandardu. Ak je menej ako šesť adekvátnych píkov (7), výsledné spektrum sa nemôže použiť ako referenčné spektrum. Skóre t.j. percento adekvátnych píkov nájdených v infračervenom spektre analytu má byť najmenej 50. Kde nie je presné vyjadrenie adekvátneho píku, príslušná oblasť spektra analytu sa má porovnávať s prítomnosťou rovnocenného píku. Postup je použiteľný len u absorbčných píkov v spektre vzorky s intenzitou najmenej trikrát pík k šumu píku.

2.3.5.Pracovné kritériá a iné požiadavky na determináciu analytu použitím LC s inými detekčnými technikami.

2.3.5.1. Chromatografická separácia
Ak je dostupný vhodný materiál na tento účel, má sa použiť interný štandard,. Najlepšie, ak ním je príbuzný štandard s retenčným časom blízkym retenčnému času analytu. Analyt má byť eluovaný v retenčnom čase, čo je typické pre korešpondujúci kalibračný štandard za rovnakých eperimentálnych podmienok. Minimálny prípustný retenčný čas pre analyt má byť dvojnásobokom retenčného času, ktorý korešponduje s prázdnym obsahom kolóny. Pomer retenčného času analytu k retenčnému času interného štandardu, t.j. relatívny retenčný čas analytu, má byť rovnaký ako retenčný čas kalibračného štandardu vo vhodnej matrici, v rozpätí  2,5 cm-1. 

2.3.5.2. Záznam celého hmotnostného spektra ( full scan ) UV/VIS detekcia

Musia byť splnené pracovné kritériá pre LC metódy.

Absorbčné maximum spektra analytu sa má pri rovnakej vlnovej dĺžke rovnať kalibračnému štandardu v rozpätí rozlišovacej schopnosti detekčného systému. Pre detektor diódového poľa je to väčšinou   2 nm. Spektrum analytu nad 220 nm , pre časti dvoch spektier s relatívnou absorbanciou 10%, nemá byť viditeľne rozdielne od spektra kalibračného štandardu. Toto kritérium sa splnení ak za prvé je prítomné rovnaké maximum a za druhé  ak rozdiel medzi dvoma spektrami nie je v žiadnom pozorovanom bode väčší než 10% absorbancie kalibračného štandardu. V prípade použitia vyhľadávacieho systému knižnice počítača a porovnateľného píku , porovnanie spektrálnych údajov testovanej vzorky s údajmi kalibračného roztoku má presiahnuť najbližší príbuzný kritický pík. Tento pík má byť stanovený počas procesu validácie pre každý analyt na základe spektra, pre sú splnené horeuvedené kritériá. Má byť skontrolovaná variabilita spektra spôsobená matricou vzorky a detektorom .

2.3.5.3. Pracovné kritériá pre fluorimetrickú detekciu

Musia byť splnené pracovné kritériá pre LC metódy.

Používa sa pre molekuly, ktoré vykazujú natívnu fluorescenciu a pre molekuly, ktoré vykazujú fluorescenciu buď po transformácii alebo derivatizácii. Výber excitačných a emisných vlnových dĺžok v kombinácii s chromatografickými podmienkami má byť vykonaný takým spôsobom, aby sa minimalizoval výskyt zložiek v extraktoch slepej vzorky.
Najbližšie maximum píka v chromatograme má byť oddelené od určeného píku analytu najmenej jedným plným píkom o šírke 10%  maximálneho vrcholu píku analytu.

2.3.5.4. Pracovné kritériá pre určenie analytu LC imunogramom

LC imunogram nie je vhodný na použitie ako konfirmačná metóda.

Musia byť splnené príslušné kritériá pre LC.

Vopred definované kontrolné parametre kvality, napríklad nešpecifické väzby, relatívne väzby kontrolných vzoriek, absorbančná hodnota blanku majú byť v limitoch získaných počas validačného  postupu.

Imunogram má byť zostavený z najmenej piatich frakcií.

Každá frakcia má byť menej než polovica šírky píku.

Frakcia s maximálnym obsahom analytu  má byť rovnaká pre podozrivú vzorku, nezhodnú kontrolnú vzorku a štandard.

2.3.5.5. Determinácia analytu použitím UV/VIS detekcie ( jednotná vlnová dĺžka )

LC s UV/VIS detekciou ( jednotná vlnová dĺžka ) nie je vhodná na použitie ako konfirmačná metóda.

Najbližšie maximum píku v chromatograme má byť oddelené od určeného  píku analytu najmenej jedným plným píkom o šírke 10%  maximálneho vrcholu píku analytu.

2.3.6.Pracovné kritériá a iné požiadavky na determináciu analytu 2-D TLC spojenú so spektrometrickou detekciou so záznamom celého hmotnostného spektra ( full scan ) 

Dvojdimenzionálna HPTLC a co-chromatografia sú záväzné.

Hodnoty RF analytu sa musia zhodovať s RF hodnotami štandard  5%.

Vizuálny vzhľad analytu má byť nerozoznateľný od štandardu.

Pre body rovnakej farby má byť oddelený stred najbližšieho bodu od stredu bodu analytu najmenej polovicou hodnoty priemerov bodov.

Spektrum analytu nemá byť vizuálne odlišné od spektra štandardu, ako je popísané pri full-scan UV/VIS detekcii. . 

V prípade použitia vyhľadávacieho systému knižnice počítača a porovnateľného píku , porovnanie spektrálnych údajov testovanej vzorky s údajmi kalibračného roztoku má presiahnuť najbližší príbuzný kritický pík. Tento faktor má byť stanovený počas procesu validácie pre každý analyt na základe spektra, ktoré spĺňa horeuvedené kritériá. Má byť skontrolovaná variabilita spektra spôsobená matricou vzorky a detektorom .

2.3.7. Pracovné kritériá a iné požiadavky pre determináciu analytu pomocou GC v kombinácii s detektorom elektrónového záchytu ( ECD )

Ak je dostupný vhodný materiál na tento účel, má sa použiť interný štandard. Najlepšie, ak ním je príbuzný štandard s retenčným časom blízkym retenčnému času analytu. Analyt má byť eluovaný v retenčnom čase, čo je typické pre korešpondujúci kalibračný štandard za rovnakých skúšobných podmienok. Minimálny prípustný retenčný čas pre analyt má byť dvojnásobokom retenčného času, ktorý korešponduje s prázdnym obsahom kolóny. Pomer retenčného času analytu k retenčnému času interného štandardu, t.j. relatívny retenčný čas analytu, má byť rovnaký ako retenčný čas kalibračného štandardu vo vhodnej matrici,v rozpätí  0,5%. Najbližšie maximum píku v chromatograme má byť oddelené od určeného  píku analytu najmenej jedným plným píkom o šírke 10%  maximálneho vrcholu píku analytu. Na dodatočné imformácie sa môže použiť co-chromatografia.

2.4. Konfirmačné metódy pre prvky
Konfirmačné metódy pre chemické prvky majú byť založené na spôsobe jednoznačnej identifikácie a správnej ako aj presnej kvantifikácii na základe fyzikálno-chemických vlastností jedinečných pre chemické prvky (napríkladcharakteristická vlnová dĺžka prvku emitovaného alebo absorbovaného radiáciou, atómová hmotnosť )na úrovni záujmu.

Nasledovné metódy alebo kombinácie metód sa považujú za vhodné na identifikáciu chemických prvkov :

Tabuľka 7
Vhodné konfirmačné metódy pre chemické prvky

Technika	Meraný parameter	
Diferenciálna pulzná anodická stripová voltametria

Atómová absorbčná spektrometria

    plameň

    generovanie hydridov

    studená para

    elektrotermálna atomizácia ( grafitová pec )

Atómová emisná spekrometria

    indukčne viazaná plazma

Hmotnostná spektrometria

    indukčne viazaná plazma
	elektrický signál

absorbčná vlnová dĺžka

absorbčná vlnová dĺžka

absorbčná vlnová dĺžka

absorbčná vlnová dĺžka

emisná vlnová dĺžka

pomer hmoty a náboja	

2.4.1. Všeobecné pracovné charakteristiky a iné požiadavky na konfirmačné metódy

Referenčný alebo fortifikavaný materiál s obsahom známeho množstva analytu, alebo v blízkosti buď povoleného limitu alebo rozhodujúceho limitu ( nezhodná kontrolná vzorka ) ako aj zhodné kontrolné materiály a slepé pokusy by mali byť pokiaľ možno realizované počas celého postupu súčasne s každou skupinou analyzovaných vzoriek testu. Doporučený postup injektovania extraktov do analytického prístroja je nasledovný : slepý pokus, zhodná kontrolná vzorka, vzorka, ktorá má byť potvrdená, zhodná kontrolná vzorka a nakoniec nezhodná kontrolná vzorka. Každá zmena tohto postupu má byť zdôvodnená.

Vo všeobecnosti väčšina analytických techník vyžaduje kompletný rozklad organickej matrice za účelom získania roztoku pred determináciou analytu. To sa môže dosiahnuť postupom mikrovlnej mineralizácie, ktorá minimalizuje riziko straty a/alebo kontaminácie analytu záujmu. Majú sa použiť dekontaminované teflónové nádoby dobrej kvality. Ak sa použije iná, mokrá alebo suchá, metóda rozkladu musí byť dostupný dokumentovaný dôkaz za účelom vylúčenia potenciálneho rizika straty alebo kontaminácie fenoménu. Ako alternatívu rozkladu, sa môže vybrať za týchto okolností separačný postup  (napríklad extrakcia ) na separáciu analytu z komponentov matrice a/alebo koncentrácie analytov za účelom ich zavedenia do analytického zariadenia.

Čo sa týka kalibrácie, tá je externá alebo založená na metóde štandardného prídavku, treba dávať pozor, aby sa neprekročilo určené pracovné rozpätie pre analýzu. V prípade externej kalibrácie, je povinné, aby boli kalibračné štandardy pripravované v roztoku, ktorý je porovnateľne blízky zloženiu roztoku vzorky. Ak to špecifické analytické okolnosti vyžadujú, môže sa použiť korekcia pozadia

2.4.2. Dodatočné pracovné kritériá a iné požiadavky na kvantitatívne analytické metódy

2.4.2.1.Pravdivosť kvantitatívnych analytických metód

V prípade opakovaných analýz certifikovaného referenčného materiálu pre prvky, odchýlka experimentálne určeného priemerného obsahu z certifikovanej hodnoty nesmie ležať mimo limitu 10%. Ak nie je dostupný taký referenčný materiál, je prijateľné, že pravdivosť merania je hodnotená cez výťažnosť prídavkov známych množstiev prvku do neznámych vzoriek.  Treba upozorniť na skutočnosť, že na rozdiel od analytu, pridaný prvok nie je chemicky viazaný v skutočnej matrici a preto výsledky získané týmto prístupom majú nižšiu validitu ako tie, ktoré sa získali použitím referenčných materiálov. Údaje o výťažnosti sú prijateľné, len ak sú 10% cieľovej hodnoty.

2.4.2.2. Presnosť kvantitatívnych metód

V prípade opakovanej analýzy vzorky  vzorka za vnútrolaboratórnych podmienok reprodukovateľnosti, vnútrolaboratórny variačný koeficient ( CV ) priemeru nesmie prekročiť nasledovné hodnoty

Tabuľka 8
CV pre kvantitatívne metódy  v rozmedzí hmotnostných zlomkov prvku

hmotnostný zlomok	CV (% )	
10 ug/kg až 100 ug/kg

>100 ug/kg až 1000 ug/kg

1000 ug/kg	20

15

10	

2.4.3. Špecifické požiadavky na diferenciálnu pulznú anodickú stripovú  voltametriu
 ( DPASV )

Najdôležitejšia je úplná deštrukcia organickej matrice vo vzorkách pred DPASV. Vo voltamogramoch nemaju byť viditeľné žiadne výrazné signály spôsobené prítomnosťou organických materiálov.  Na výšku píku môžu mať vplyv anorganické zložky matrice. Preto sa má kvantifikácia vykonávať metódou štandardného prídavku. Metóda poskytne vzorky typických voltamogramov  roztoku vzorky.

2.4.4. Špecifické požiadavky na atómovú absorbčnú spektrometriu ( AAS )

Metóda je v podstate monoprvková a preto vyžaduje optimalizáciu experimentálnych nastavení závislú na jednotlivom kvantifikovanom prvku. Všade kde je možné, výsledky skontrolovať kvalitatívne a kvantitatívne použitím alternatívnych absorbčných čiar ( ideálne, vybrať dve rôzne čiary ). Kalibračné štandardy pripraviť v roztoku matrice, ktorý je porovnateľne blízky zloženiu roztoku meranej vzorky ( napríklad koncentrácia kyseliny alebo modifikátor zloženia ). Za účelom minimalizácie slepých hodnôt majú byť všetky reagencie  najvyššej dostupnej čistoty. V závislosti od zvoleného spôsobu odparovania a/alebo atomizácie vzorky sa môžu rozlišovať rôzne typy AAS.

2.4.4.1. Špecifické požiadavky pre plameňovú AAS

Nastavenia prístroja optimalizovať pre každý prvok. Má sa skontrolovať hlavne zloženie plynu a prietoková rýchlosť. Aby sa zabránilo interferenciám spôsobeným pozadím absorbcie použije sa nepretržitý korektor zdroja. V prípade neznámych matríc má byť vykonaná kontrola či je potrebná korekcia pozadia.

2.4.4.2. Špecifické požiadavky na AAS s grafitovou pieckou

Kontaminácia v laboratóriu často ovplyvňuje správnosť, ak sa pracuje v ultra-stopových hladinách v grafitovej peci. Preto sa vyžaduje vysoká čistota reagencií, deionizovanej vody, inertné plastické výrobky na vzorky a štandardné zaobchádzanie. Nastavenia prístroja pre každý prvok majú byť optimalizované. Skontrolovať najmä predbežnú úpravu a podmienky atomizácie ( teplota, čas ) a modifikáciu matrice.

Práca za podmienok izotermálnej atomizácie [napríklad priečny ohrev grafitovej skúmavky s integrovaním Lvov-ej platformy (8)] zníži vplyv matrice čo sa týka atomizácie analytu. V kombinácii s modifikáciou matrice a korekciou pozadia podľa Zeeman - a je povolená kvantifikácia pomocou kalibračnej krivky založenej na meraní vodného štandardného roztoku.

2.4.5. Špecifické požiadavky naatómovú absorbčnú spekrotometriu s generovaním hydridov

Organické zlúčeniny s obsahom prvkov ako arzén, bizmut, germánium, olovo, antimón, selén, cín a telúr môžu byť veľmi stabilné a vyžadujú oxidačný rozklad na získanie správnych výsledkov pre celkový obsah prvkov. Preto sa doporučuje mikrovlnný rozklad  alebo vysokotlaková mineralizácia za  vyhranených oxidačných podmienok. Najväčšiu pozornosť venovať úplnej  a reprodukovateľnej konverzii ich  príslušných hydridov. 

Tvorba arzénu v roztoku kyseliny chlorovodíkovej s NaBH4 závisí od oxidačného stupňa arzénu ( As III : rýchla tvorba, AsV : dlhšia doba vzniku ). aby sa zabránilo strate senzitivity pre určenie  AsV prietokovou injekčnou technikou, zapríčinenou krátkym reakčným časom v tomto systéme, AsV má  byť redukovaný na AsIII po oxidačnom rozklade. Na tento účel sú vhodné jodid draslíka/ kyselina askorbová alebo cysteín. Slepé kalibračné roztoky a roztoky vzorky sú ošetrené rovnakým spôsobom. Práca so systémom skupiny umožňuje určenie oboch druhov arzénu bez ovplyvnenia správnosti. Kvôli oneskorenej tvorbe AsV-hydridu sa kalibrácia vykonáva integráciou plochy píku. Nastavenia prístroja majú byť optimalizované. Je veľmi dôležitý  prietok plynu, ktorý nesie hydrid do atomizátora a má byť kontrolovaný.

2.4.6. Špecifické požiadavky pre atómovú absorbčnú spektrometriu s generáciou studenej pary 

Studená para sa používa len v prípade ortute. Z dôvodu odparovania a adsorbčných strát elementárnej ortute, počas celej analýzy sa vyžaduje osobitná pozornosť. Pozorne predísť kontaminácii reagentami alebo prostredím.

Organické zlúčeniny s obsahom ortuti vyžadujú oxidačný rozklad, aby sa získali výsledky celkového obsahu ortuti. Na rozklad sa používajú uzatvorené systémy s mikrovlného rozkladu alebo vysokotlaková mineralizácia. Osobitná pozornosť sa vyžaduje pri čistení zariadenia, ktoré malo kontakt s ortuťou.

Práca s prietokovými injekčnými technikami je výhodná. Pre nižšie rozhodujúce limity sa doporučuje adsorbcia elementálnej ortuti na adsorberi zlato/platina, za ktorou  nasleduje desorbcia.  Meranie ruší kontakt adsorbera alebo buňky s vlhkosťou a treba mu predísť.

2.4.7. Špecifické požiadavky na emisnú atómovú spektrometriu s indukčne viazanou plazmou (ICP-AES)

Atómová emisná spektrometria s indukčne viazanou plazmou (10) je multiprvková metóda, ktorá umožňuje súčasné meranie rôznych prvkov. Vzorky pre ICP-AES sú najprv vylúhované za účelom rozkladu organickej matrice. Použijú sa uzatvorené systémy mikrovlného rozkladu alebo vysokotlaková mineralizácia. Pre účelnú ICP-AES analýzu hrá hlavnú úlohu kalibrácia prístroja a výber prvku alebo vlnovej dĺžky. Pre kalibráciu prístroja, v prípade lineárnych kalibračných kriviek, je zvyčajne potrebné merať kalibračné roztoky len štyroch koncentrácií, pretože ICP-AES kalibračné krivky sú vo všeobecnosti lineárne v rozsahu štyroch až šiestich poriadkov koncentrácie. Kalibrácia ICP-AES systému sa normálne vykonáva s multiprvkovým štandardom, ktorý je pripravený v roztoku, ktorý má rovnakú koncentráciu kyseliny ako merací roztok. Pre lineárnu krivku skontrolovať koncentrácie prvku.

Výber vlnových dĺžok nameranie emisie z analytov je vhodný pre koncentrácie prvkov, ktoré majú byť určené. Ak je koncentrácia analytu mimo pracovného rozsahu emisnej čiary, použijú sa rôzne emisné čiary. Najprv sa vyberie najsenzitívnejšia emisná čiara (nie interferovaná ), potom najmenej senzitívna čiara. Ak sa pracuje v alebo blízko limitu detekcie, najlepším výberom je najsenzitívnejšia čiara pre príslušný analyt. Interferencie pozadia a spektra sú príčinou najväčších ťažkostí ICP-AES. Možné interferencie sú napríklad jednoduchý posun pozadia, posun pozadia so sklonom, priamy prekryv spektier a zložitý posun pozadia. Každá z týchto interferencií má svoje vlastné príčiny a opravné prostriedky. V závislosti na matriciach sa použijú korekcie interferencie a optimalizácia pracovných parametrov. Niektorým interferenciám sa dá predísť riedením alebo prispôsobením matríc. S každou skupinou testovaných vzoriek má byť ošetrený rovnakým spôsobom ako testované vzorky referenčný a fortifikovaný materiál o známom obsahu analytu (ov) ako aj slepý materiál. Za účelom testovania odchýlky sa kontroluje štandard po desiatich vzorkách. Všetky reagenty a plyn plazmy majú byť najvyššej dostupnej čistoty.

2.4.8. Špecifické požiadavky pre indukčne viazanú hmotnostnú spekrometriu (ICP-MS)(11)

Určenie stopových prvkov strednej molekulovej hmotnosti ako chróm, meď a nikel môže byť predmetom silnej interferencie z ostatných izobarických a polyatomických iónov. Tomu sa dá predísť len ak je dostupná rozlišovacia schopnosť najmenej 7000 až 8000. Ťažkosti spájané s MS technikami zahŕňajú šum prístroja, vplyvy matrice a molekulárnu iónovú interferencia 
( m/z < 80). Na korekciu šumu prístroja sa vyžaduje viacnásobná interná štandardizácia pokrývajúca rovnaký hmotnostný rozsah ako prvky, ktoré majú byť determinované.

Pre ICP-MS merania sa vyžaduje  úplný rozklad organickej matrice vzorky. Ako pri AAS, po rozpustení v uzatvorených nádobách, prchavé prvky ako napríklad iód sú prenesené do stabilného oxidačného štádia. Najvážnejšia interferencia pochádza z kombinácií molekulárnych iónov argónu ( plazma plyn ), vodíka, uhlíka, dusíka a kyslíka (rozkladné kyseliny, nečistoty plazmy a plynu a privodené atmosferické plyny ) a matrice vzorky. Aby sa predišlo interferenciám, vyžaduje sa úplné vylúhovanie, meranie pozadia, vhodný výber analytických hmotností  niekedy spojených s nižším výskytom (horší detekčný limit) a rozkladné kyseliny napríklad kyselina dusičná.

Pre prvky, ktoré majú byť určené, sa  vylúčia interferencie vhodným výberom špecifických analytických hmotností vrátane potvrdenia izotopového pomeru. Pre každé meranie sa má použitím interných štandardov  skontrolovať odozva prístroja vzhľadom k Fano faktorom.

3.Validácia

Validácia má dokázať, že analytické metódy sú v zhode s kritériami príslušných pracovných charakteristík.
Rôzne kategórie metód vyžadujú rôzne kontrolné ciele. Nasledovná tabuľka určuje pracovné charakteristiky, ktoré majú byť verifikované pre príslušný typ .

Tabuľka 9
Klasifikácia analytických metód pracovnými charakteristikami, ktoré majú byť určené

		rozhodujúci limit 
CC β	rozhodujúci limit
CC α	Pravdivosť/
výťažnosť	Presnosť	Selektivita/
špecifikosť	Použiteľnosť/
robustnosť/
stabilita	
kvalitatívne	S	+	-	-	-	+	+	
metódy	C	+	+	-	-	+	+	
kvantitatívne	S	+	-	-	+	+	+	
metódy	C	+	+	+	+	+	+	

S = screeningová metóda, C= konfirmačná metóda, + determinácia je povinná

3.1. Validačné postupy
Táto kapitola poskytuje príklady a/alebo odkazy pre validačné postupy analytických metód. Môžu sa použiť iné prístupy, ktoré dokážu, že dosiahnu rovnakú úroveň kvality informácie a ktoré demonštrujú , že analytická metóda vyhovuje  pracovným kritériám pre pracovné charakteristiky.

Validácia sa môže tiež vykonať vedením interlaboratórnych štúdií podľa Codex Alimentarius, ISO alebo IUPAC (12), alebo podľa alternatívnych metód ako sú jednotlivé laboratórne štúdie alebo vnútrolaboratórna validácia (13)(14). Táto časť je zameraná na jednotlivé laboratórne štúdie ( na vnútrolaboratórnu validáciu ) použitím modulárnenho prístupu. Tento prístup pozostáva z :

1.	ustanovenia všeobecných pracovných charakteristík nezávislých od použitého modelu validácie a
2.	viac špecifických model-závislých postupov, ako sú opísané v tabuľke 10.

Tabuľka 10
Model-nezávislé a model-závislé pracovné parametre

Validácia	
Model-nezávislé pracovné charakteristiky	Model-závislé pracovné charakteristiky	
Všeobecné pracovné charakteristiky (3.1.1.)	Bežný validačný prístup (3.2.1.)	Vnútrolaboratórny validačný prístup	
špecifickosť

pravdivosť

robustnosť . menšie zmeny

stabilita	výťažnosť

opakovateľnosť

vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť

reprodukovateľnosť

rozhodujúci limit ( CC α)

detekčná schopnosť ( CC β )

kalibračné krivky

robustnosť : väčšie zmeny
	výťažnosť

opakovateľnosť

vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť

reprodukovateľnosť

rozhodujúci limit ( CC α)

detekčná schopnosť ( CC β )

kalibračné krivky

robustnosť 	

3.1.1.Model-nezávislé pracovné charakteristiky

Bez ohľadu na vybraný validačný prístup majú byť určené nasledovné pracovné chakteristiky. Na minimalizáciu pracovného zaťaženia možno použiť starostlivo navrhnutý a štatisticky rozumný prístup na kombináciu pokusov, ktoré slúžia na určenie rôznych parametrov.

3.1.1.1.Špecifickosť

Pre analytické metódy je dôležitý potenciál rozlíšenia medzi analytom a  blízko príbuznými látkami ( izoméry, metabolity, produkty degradácie, endogénne látok, zložky matrice, 
atď ). Na kontrolu interferencií sú potrebné dva prístupy.

Z toho dôvodu  majú byť vybraté interferujúce látky a majú byť analyzované príslušné slepé vzorky na detekciu prítomnosti možných interferencjí a na odhad účinku interferencií

a)	vybrať rozsah chemicky príbuzných zložiek (metabolity, deriváty, atď.) alebo iných látok, ktoré sa pravdepodobne stretli so zložkou záujmu, ktoré môžu byť prítomné vo vzorkách;
b)	analyzovať vhodný počet slepých vzoriek ( n  20 ) a kontrolovať všetky interferencie 
c)	(signály, píky, stopové ióny) v oblasti záujmu, v ktorej sa očakáva eluovanie cieľového analytu;
d)	dodatočne fortifikovať reprezentatívne slepé vzorky príslušnou koncentráciou látok, ktoré pravdepodobne interferujú s identifikáciou a/alebo kvantifikáciou analytu,
e)	po analýze preskúmať či 
f)	prítomnosť môže viesť k falošnej identifikácii,
g)	je identifikácia cieľového analytu brzdená prítomnosťou jednej alebo viacerých interferencií alebo
h)	je obzvlášť ovplyvnená kvantifikácia.

3.1.1.2. Pravdivosť

V tejto časti je opísané určenie pravdivosti ( zložka správnosti ). Pravdivosť môže byť potvrdená len pomocou certifikovaného referenčného materiálu ( CRM ).  Vždy sa použije dostupný CRM. Postup je podrobne popísaný v slovenskej technickej norme4). Nižšie je uvedený príklad :
a)	analyzovať šesť replikátov CRM v súlade s návodom metódy,
b)	určiť koncentráciu prítomného analytu v každej vzorke replikátov,
c)	vypočítať pre tieto koncentrácie priemer, smerodajnú odchýlku a variačný koeficient ( %),
d)	vypočítať pravdivosť vydelením určenej priemernej koncentrácie certifikovanou hodnotou ( meranej ako koncentrácia ) a vynásobiť 100 na vyjadrenie výsledku v percentách.

Pravdivosť (%) = priemerná detekovaná výťažnosť-korigovaná koncentráciou x 100/ certifikovaná hodnota

Ak nie je dostupný CRM, namiesto správnosti, môže sa určiť výťažnosť, ako je opísané nižšie v 4.1.2.1.

3.1.1.3.Použiteľnosť/robustnosť ( menšie zmeny )

Tieto  štúdie využívajú úmyselné zavedenie malých primeraných obmien laboratóriom a sledovanie ich následkov.

Pred-vyšetrovacie  štúdie sa uskutočňujú výberom faktorov predbežnej úpravy vzorky, čistenia a analýzy, ktoré majú vplyv na výsledky merania. Takéto faktory majú zahŕňať analytika, zdroj a vek reagentov, rozpúšťadlá, štandardy a extrakty vzoriek, rýchlosť zahrievania, teplotu, hodnotu pH ako aj mnoho iných faktorov, ktoré sa môžu vyskytnúť v laboratóriu. 

1.	Identifikovať možné faktory, ktoré môžu ovplyvniť výsledok.
2.	Mierne meniť každý faktor.
3.	Previesť test robustnosti použitím prístupu podľa Youdena(15)(16). ( V tomto bode možno použiť iné konfirmačné metódy. Prístup podľa Youden, dodržiava minimum požadovaného času a výkonu). Prístup podľa Youden je frakčný faktorový dizajn. Nemôžu byť detekované interakcie medzi dvoma rozličnými faktormi.
4.	Kde sa nájde faktor, ktorý významne ovplyvňuje výsledok, riadiť ďalšie pokusy tak, aby sa rozhodlo o prijateľnosti limitov tohto faktora.
5.	Faktory, ktoré významne ovplyvňujú výsledky majú byť jasne identifikované v protokole metódy.

Základnou myšlienkou nie je štúdium jednej zmeny v čase, ale zavedenie niekoľkých variácií naraz. Ako príklad označte nominálne hodnoty siedmych faktorov A, B, C, D, E, F, G, ktoré môžu ovplyvňovať výsledok, ak sa ich nominálne hodnoty mierne zmenia. Označte ich obmenené hodnoty malými písmenami a, b, c, d, e, f a g. Výsledkom je 27 alebo 128 rôznych možných kombinácií.

Je možné vybrať podskupinu ôsmych týchto kombinácií, ktoré majú rovnováhu medzi veľkými a malými písmenami ( tabuľka 11 ). Má sa urobiť osem determinácií, ktoré využijú kombináciu vybraných faktorov ( A – G ). Výsledky determinácií ukazuje tabuľka 11 nižšie ako S – Z.

Tabuľka 11
Experimentálny projekt pre štúdium robustnosti ( menšie zmeny )

Hodnota faktora F	Kombinácia počtu determinácií	
	1	2	3	4	5	6	7	8	
A/a

B/b

C/c

D/d

E/e

F/f

G/g	A

B

C

D

E

F

G	A

B

c

D

e

f

g	A

b

C

d

E

f

g	A

b

c

d

e

F

G	a

B

C

d

e

F

g	a

B

c

d

E

f

G	a

b

C

D

e

f

G	a

b

c

D

e

F

g
	
Pozorovaný výsledok R	S	T	U	V	W	X	Y	Z	
 Pre výpočet pozri príklady testovania robustnosti v 3.3.

3.1.1.4. Stabilita

Bolo pozorované, že nedostatočná stabilita analytu alebo zložiek matrice vo vzorke počas skladovania alebo analýzy môže zvýšiť významne odchýlky výsledku  analýzy. Ďalej má byť ešte skontrolovaná stabilita kalibračného štandardu v roztoku. Stabilita analytu je zvyčajne dobre charakterizovaná za rôznych podmienok skladovania.  Monitoring skladovacích podmienok má tvoriť časť bežného laboratórneho akreditačného systému. Ak to nie je známe, nižšie sú uvedené príklady ako môže byť determinovaná stabilita .

Stabilita analytu v roztoku :

1.	Pripraviť čerstvé zásobné roztoky analytu (ov ) a riediť ako je určené návodom testu, aby vznikli častí ( napr.40) z každej vybranej koncentrácie v blízkosti minima požadovaného pracovného limitu pre látky, pre ktoré nebol stanovený povolený limit a v blízkosti povoleného limitu u ostatných látok. Pripraviť dva roztoky analytu, jeden sa použije na fortifikáciu a druhý na finálny roztok analýzy a akýkoľvek iný roztok záujmu (napríklad odvodené štandardy).
2.	Merať obsah analytu v čerstvo pripravenom roztoku podľa návodov testu.
3.	Rozdeliť primerané objemy do vhodných nádob, označiť a skladovať podľa schémy.

Tabuľka 12
Schéma pre určenie stability analytu v roztoku

	- 20°C	+ 4°C	+ 20°C	
tma

svetlo	10 častí	10 častí	10 častí

10 častí

1.	Zvolená doba skladovania môže byť jeden, dva, tri a štyri týždne, alebo dlhšie, ak to je potrebné, t.j. až kým sa dá pozorovať prvý degradačný jav počas identifikácie a/alebo kvantifikácie. Zaznamená sa maximálna doba skladovania a optimálne skladovacie podmienky.
2.	Výpočet koncentrácie analytu  ( ov ) v dávke sa má vykonať tak, že 100% je  roztok čerstvo pripraveného analytu v čase analýzy.

Zostávajúci analyt (%) = Ci x 100/C čerstvý

Ci  = koncentrácia v čase merania
C čerstvý = koncentrácia čerstvého roztoku

Stabilita analytu ( ov ) v matrici

1.	Vždy keď je možné majú sa použiť zaslané vzorky. Ak nie je dostupný zaslaný materiál, má sa použiť matrica fortifikovaná analytom.
2.	Ak je dostupný zaslaný materiál, stanoviť  koncentráciu v materiály, kým je čerstvý. Ďalšie časti materiálu sa majú odobrať po jednom, dvoch, štyroch a dvadsiatich týždňoch a  stanoviť koncentráciu. Ak je  potrebné, tkanivo sa má skladovať pri teplote najmenej – 20°C.
3.	Ak nie je dostupný zaslaný materiál, zobrať slepý materiál a zhomogenizovať  ho. Rozdeliť materiál na päť častí. Fortifikovať každú časť analytom, ktorý má byť pripravený pokiaľ možno v malom množstve vodného roztoku. Ihneď analyzovať jednu časť. Ostatné časti skladovať pri teplote najmenej – 20°C, alebo ak je potrebné nižšej a analyzovať ich po jednom, dvoch, štyroch a dvadsiatich týždňoch.

3.1.1.5. Kalibračné krivky

Ak sa kalibračné krivky používajú na kvantifikáciu
a)	na zostrojenie krivky sa má použiť najmenej päť úrovní ( vrátane nuly ),
b)	má byť charakterizovaný pracovný rozsah krivky,
c)	majú byť charakterizované matematický vzorec krivky a test dobrej zhody údajov krivky,
d)	má byť charakterizovaná prípustnosť rozsahov pre parametre krivky.

Ak je potrebná sériová kalibrácia založená na štandardnom roztoku, má byť vyjadrená prípustnosť rozsahov pre parametre kalibračnej krivky, ktoré sa môžu meniť od série k sérii.

3.1.2. Obvyklé validačné postupy 

Výpočet údajov v súlade s obvyklými metódami vyžaduje realizáciu niekoľkých individuálnych experimentov. Každá pracovná charakteristika má byť determinovaná pre každú väčšiu zmenu ( pozri vyššie pod použiteľnosť/robustnosť ). U multianalytových metód, môže byť analyzovaných súčasne viac analytov, ak je možné vopred sa vylúčia príslušné možné interferencie. Rovnakým spôsobom je možné určiť niektoré pracovné charakteristiky. Na zníženie pracovného zaťaženia sa doporučuje čo najviac možných  kombinácií experimentov (napríklad opakovateľnosť a vnútrolaboratórnu reprodukovateľnosť so špecifickosťou, analýzu slepých vzoriek na určenie rozhodujúceho limitu a testovanie na špecifickosť ).

3.1.2.1. Výťažnosť
Ak nie je dostupný CRM, výťažnosť sa určuje skúškami za použitia fortifikovanej slepej matrice napríklad použitím nasledujúcej schémy 
a)	vybrať 18 častí slepého materiálu a fortifikovať šesť častí,  každú 1, 1,5 a dvojnásobkom najnižšieho požadovaného pracovného limitu alebo 0,5, 1 a jeden a pol násobkom povoleného limitu,
b)	analyzovať vzorky a vypočítať koncentráciu prítomnú v každej vzorke,
c)	použitím doleuvedenej rovnice vypočítať výťažnosť pre každú vzorku,
d)	vypočítať priemernú výťažnosť a CV zo šiestich výsledkov v každej úrovni,
e)	% výťažnosti = 100 x nameraný obsah / fortifikačná úroveň .

Táto obvyklá metóda determinácie výťažnosti je variantom metódy štandardného prídavku popísanej v 3.5., ak 

-	je vzorka považovaná za slepú vzorku namiesto vzorky na analýzu,
-	sa predpokladá, že výťažok(1) a výťažnosť(2) sú rovnaké pre obidve časti testu,
-	testované vzorky majú rovnakú hmotnosť a extrakty rovnaký objem,
-	množstvo kalibračného štandardu, ktorý sa pridá do druhej ( s prídavkom ) časti testu je vyjadrený XADD. (XADD = ρA . VA ),
-	x1 je nameraná hodnota pre blank a x2 nameraná hodnota pre druhú ( s prídavkom ) časti testu,
-	potom, % výťažnosti = 100 ( x2 – x1 )/ XADD

Ak sa nedosiahne ktorákoľvek z horeuvedených podmienok, alebo je predpoklad, že sa nedosiahne, potom sa vykoná úplný postup na determináciu výťažnosti metódou štandardného prídavku ako je uvedené v 3.5.

Vysvetlivky 
(1)	Výťažok : tá časť hmoty analytu obsiahnutá vo vzorke, ktorá je prítomná vo finálnom extrakte.
(2)	Výťažnosť ( tu ) : tá časť hmoty analytu pridaná k vzorke, ktorá je prítomná vo finálnom extrakte. Všade v zvyšku dokumentu sa predpokladá, že výťažok a výťažnosť sú rovnaké a preto sa používa len termín „výťažnosť“

3.1.2.2. Opakovateľnosť

1.	Pripraviť sadu vzoriek rovnakých matríc, fortifikovať analytom, aby sa získali koncentrácie rovné 1, 1,5 a dvojnásobku najnižšieho požadovaného pracovného limitu a jeden a pol násobku povoleného limitu.
2.	V každej hladine analýzy sa má pracovať najmenej so šiestimi replikátmi.
3.	Analyzovať vzorky.
4.	Vypočítať koncentráciu zistenú pre každú vzorku.
5.	Zistiť priemernú koncentráciu, smerodajnú odchýlku a variačný koeficient (%) fortifikovaných vzoriek.
6.	Opakovať tieto kroky pri najmenej dvoch iných príležitostiach.
7.	Vypočítať súhrnné priemerné koncentrácie a CV pre fortifikované vzorky.

3.1.2.3. Vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť

1.	Pripraviť sadu vzoriek špecifického materiálu testu (rovnakých alebo rôznych matríc) fortifikovaných analytom ( analytmi ) , aby sa získali koncentrácie rovné 1, 1,5 a dvojnásobku najnižšieho požadovaného pracovného limitu alebo 0,5, 1 a jeden a pol násobku povoleného limitu.
2.	V každej hladine analýzy sa má pracovať najmenej so šiestimi replikátmi.
3.	Ak je to možné opakovať tieto kroky pri najmenej dvoch iných príležitostiach s rôznymi operátormi a za rôznych podmienok vonkajšieho prostredia napríklad rôzne výrobné dávky reagentov, rozpúšťadiel, atď, rôzna izbová teplota, rôzne prístroje, atď.
4.	Analyzovať vzorky.
5.	Vypočítať koncentráciu zistenú pre každú vzorku.
6.	Zistiť priemernú koncentráciu, smerodajnú odchýlku a variačný koeficient (%) fortifikovaných vzoriek.

3.1.2.4. Reprodukovateľnosť

Ak bola overená reprodukovateľnosť, laboratóriá sa môžu zúčastňovať na porovnávacích štúdiách podľa slovenskej technickej normy5) 

3.1.2.5. Rozhodujúci limit ( CC α)

Rozhodujúci limit má byť zavedený podľa požiadaviek na identifikáciu alebo identifikáciu a kvantifikáciu ako je definované v Pracovných kritériách a ostatných požiadavkách pre analytické metódy v časti 2.

V prípade látok, pre ktoré nie je ustanovený povolený limit, CCα  môže byť stanovené :
a)	buď postupom kalibračnej krivky podľa slovenskej technickej normy6)( tu sa počíta ako kritická hodnota čistej stavovej premennej ). V tomto prípade sa má použiť slepý materiál, ktorý je fortifikovaný v a nad najnižšou požadovanou pracovnou hladinou v ekvidistantných krokoch. Analyzovať vzorky. Po identifikácii vniesť do grafu signál oproti pridanej koncentrácii. Korešpondujúca koncentrácia v úseku na osi y plus 2,33 krát smerodajná odchýlka zachytenej vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti sa rovná rozhodujúcemu limitu. Je to vhodné len pre kvantitatívne postupy (α = 1% ) alebo
b)	analyzovaním najmenej 20 slepých materiálov na matricu, aby bolo možné vypočítať pomer signálu k šumu v časovom okne, v ktorom sa očakáva analyt. ako rozhodujúci limit je možné použiť trojnásobok pomeru signál/šum. Je to vhodné pre kvantitatívne a kvalitatívne postupy.

V prípade látok s ustanoveným povoleným limitom, CCα  môže byť stanovené
a)	buď postupom kalibračnej krivky podľa slovenskej technickej normy6) ( tu sa počíta ako kritická hodnota čistej stavovej premennej ). V tomto prípade sa má použiť slepý materiál, ktorý je fortifikovaný približne povoleným limitom v ekvidistantných krokoch. Analyzovať vzorky. Po identifikácii vniesť do grafu signál oproti pridanej koncentrácii. Korešpondujúca koncentrácia v povolenom limite plus 1,64 krát smerodajná odchýlka vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti sa rovná rozhodujúcemu limitu (α = 5% ) alebo
b)	analyzovaním najmenej 20 slepých materiálov na matricu, fortifikovaných analytom ( mi ) v povolenom limite. Korešpondujúca koncentrácia v povolenom limite plus 1,64 krát smerodajná odchýlka vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti sa rovná rozhodujúcemu limitu (α = 5% ).

3.1.2.6. Detekčná schopnosť ( CC β )

Detekčná schopnosť sa určí podľa požiadaviek na screening, identifikáciu alebo identifikáciu a kvantifikáciu ako je uvedené v časti 2.

V prípade látok s ustanoveným povoleným limitom, CC β môže byť stanovené :
a)	postupom kalibračnej krivky podľa slovenskej technickej normy6) ( tu sa počíta ako najnižšia detekovateľná hodnota čistej stavovej premennej ). V tomto prípade sa má použiť slepý materiál, ktorý je fortifikovaný v a pod najnižšou požadovanou pracovnou hladinou v ekvidistantných krokoch. Analyzovať vzorky. Po identifikácii vniesť do grafu signál oproti pridanej koncentrácii. Korešpondujúca koncentrácia v rozhodujúcom limite plus 1,64 krát smerodajná odchýlka vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti priemerného nameraného obsahu v rozhodujúcom limite sa rovná detekčnej schopnosti (β = 5% ),
b)	analyzovaním najmenej 20 slepých materiálov na matricu, fortifikovaných analytom ( mi ) v rozhodujúcom limite. Analyzovať vzorky a identifikovať analyty. Hodnota rozhodujúceho limitu plus 1,64 krát smerodajná odchýlka vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti nameraného obsahu sa rovná detekčnej schopnosti (β = 5% ),
c)	kde nie sú dostupné kvantitatívne výsledky, detekčná schopnosť sa môže určiť vyšetrením fortifikovaného slepého materiálu v a nad rozhodujúcim limitom. V tomto prípade hladina koncentrácie, kde zostáva len <= 5% falošne zhodných výsledkov, sa rovná detekčnej schopnosti metódy. Z toho dôvodu, sa má vykonať najmenej 20 vyšetrení v najmenej jednej hladine koncentrácie za účelom zaistenia hodnoverného základu tejto determinácie.

V prípade látok, pre ktoré bol ustanovený detekčný limit CC β môže byť stanovené 
a)	buď postupom kalibračnej krivky podľa slovenskej technickej normy6)  ( tu sa počíta ako najnižšia detekovateľná hodnota čistej stavovej premennej ). V tomto prípade sa použije zástupca slepého materiálu, ktorý je fortifikovaný približne povoleným limitom v ekvidistantných krokoch. Analyzovať vzorky a identifikovať analyt ( y ). Vypočítať smerodajnú odchýlku priemeru nameraného obsahu v rozhodujúcom limite. Korešpondujúca koncentrácia v hodnote rozhodujúceho limitu plus 1,64 krát smerodajná odchýlka vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti sa rovná detekčnej schopnosti (β = 5% ), alebo
b)	analyzovaním najmenej 20 slepých materiálov na matricu, fortifikovaných analytom (mi) v rozhodujúcom limite. Hodnota rozhodujúceho limitu plus 1,64 krát korešpondujúca smerodajná odchýlka sa rovná detekčnej schopnosti (β = 5% ).

3.1.2.7. Robustnosť ( väčšie zmeny )

Analytické metódy by mali byť testované za rôznych pokusných podmienok, ktoré zahŕňajú napríklad, rôzne druhy, rôzne matrice alebo rôzne podmienky vzorkovania. Vnesené zmeny by mali byť veľké. Môže byť vyhodnotená dôležitosť týchto zmien, napríklad použitím prístupu podľa Youden (15)(16). Pre všetky väčšie zmeny, u ktorých sa ukázalo, že majú významný vplyv  na prácu so vzorkou, by mala byť determinovaná každá pracovná charakteristika.

3.1.3. Validácia podľa alternatívnych modelov

Ak sa používajú alternatívne validačné postupy, vo validačnom protokole sa uvedie základný model a stratégia s príslušnými nutnými potrebami, predpokladmi a vzorcami, alebo aspoň odkazy na ich použiteľnosť. Ďalej je uvedený príklad pre alternatívny prístup. Ak sa použije napríklad vnútrolaboratórny model validácie, pracovné charakteristiky sú určené spôsobom, umožňuje validáciu väčších zmien v rovnakom validačnom postupe. To vyžaduje návrh experimentálneho plánu validácie.

3.1.3.1. Experimentálny plán

Experimentálny plán má byť navrhnutý v závislosti od počtu rôznych druhov a rôznych faktorov skúmania. Preto má prvý krok samotného postupu validácie zvážiť počet vzoriek, ktorý bude analyzovaný v budúcnosti v laboratóriu za účelom výberu najdôležitejších druhov a tých faktorov, ktoré môžu mať vplyv na výsledky merania. Následne sa vyberie koncentračný rozsah spôsobom účelu prispôsobeným podľa úrovne záujmu.

Príklad :

1.	niektoré analyty sa môžu vyšetrovať súbežne analytickou metódou, ktorá má byť validovaná,
2.	boli identifikované zmeny vedúcich faktorov ( A a B ). Vedúce faktory tvoria základ na ktorom sú kombinované hladiny faktorov. Tieto faktory môžu zahŕňať faktory ako druhy alebo matricu. V tomto príklade sa vedúci faktor menil v dvoch hladinách t.j. boli vzaté do úvahy dva rôzne druhy ( druhy A a B ) . Vo všeobecnosti je možné meniť vedúce faktory na viac ako dvoch úrovniach, čo len zvyšuje počet analýz, ktoré majú byť vykonané.
3.	vybrané faktory sa menia v dvoch hladinách ( označené ako buď + alebo - )

Tabuľka 13
Príklady faktorov, ktoré sú považované za dôležité pri validačnom postupe

pohlavie zvieraťa					( faktor 1 )

plemeno						( faktor 2 )

transportné podmienky				( faktor 3 )

podmienky skladovania				( faktor 4 )

čerstvosť vzorky					(faktor 5 )

podmienky výkrmu					(faktor 6 )

rôzny operátori s rôznymi skúsenosťami		(faktor 7 )

Tabuľka 14
Možný skúšobný plán pre horeuvedený príklad

Druh	faktor 1	faktor 2	faktor 3	faktor 4	faktor 5	faktor 6	faktor 7	č.vzorky	
A

A

A

A

A

A

A

A	+

+

+

+

-

-

-

-
	+

+

-

-

+

+

-

-	+

-

+

-

+

-

+

-	+

-

-

+

-

+

+

-	-

+

-

+

+

-

+

-	+

-

-

+

+

-

-

+	-

-

+

+

+

+

-

-	1

2

3

4

5

6

7

8

Druh	faktor 1	faktor 2	faktor 3	faktor 4	faktor 5	faktor 6	faktor 7	č.vzorky	
B

B

B

B

B

B

B

B	+

+

+

+

-

-

-

-
	+

+

-

-

+

+

-

-	+

-

+

-

+

-

+

-	+

-

-

+

-

+

+

-	-

+

-

+

+

-

+

-	+

-

-

+

+

-

-

+	-

-

+

+

+

+

-

-	9

10

11

12

13

14

15

16

Každá vzorka ( každá hladina kombinácie faktora ) má byť obohatená štyrmi rôznymi koncentráciami  v blízkosti úrovne záujmu, pre každú hladinu sa analyzuje jedna slepá vzorka, 5 x 16 = 80 analytov bude spracovaných v samotnom validačnom pokuse.

Výsledky z týchto 80 meraní je možné vypočítať (13)(14).

Výťažnosť 
1.	opakovateľnosť per úroveň koncentrácie (sir),
2.	vnútrolaboratórna reprodukovateľnosť per úroveň koncentrácie (sir),
3.	rozhodujúci limit (CCα ),
4.	detekčná schopnosť (CC β ),
5.	silová krivka ( miera  β chyby oproti koncentrácii ( pozri 3.1.3.2.),
6.	robustnosť väčších zmien, robustnosť menších zmien môže byť určená podľa odseku 3.1.1.3.
7.	16 kalibračných kriviek vzťahujúcim sa na vzorky,
8.	jedna celková kalibračná krivka,
9.	predpokladaný interval celkovej kalibračnej krivky,
10.	odchýlka indukovaná matricou (smat),
11.	odchýlka indukovaná pokusom (srun),
12.	vplyv individuálnych faktorov na výsledky merania.

Tieto pracovné charakteristiky dovoľujú úplné vyhodnotenie pracovnej hladiny metódy, pretože sa neskúma len vplyv jednotlivých faktorov, ale tiež príslušných kombinácií týchto faktorov. Pomocou tohto náčrtu pokusu je možné rozhodnúť či má byť z celkovej kalibračnej krivky vylúčený jeden alebo viac faktorov, pretože sa významne odchyľujú od smerodajných odchýlok ostatných faktorov.

3.1.3.2. Silová krivka

Silová krivka poskytuje informácie o detekčnej schopnosti metódy vo vybranom rozsahu koncentrácie. Ak sa použije vyšetrovaná metóda týka sa β chyby . Silová krivka umožňuje výpočet detekčných schopností pre príslušné kategórie metód pre určitú  β chybu (napríklad 
5 %)
(screening, konfirmácia ) alebo typy ( kvalitatívne alebo kvantitatívne ).

Obrázok1
Silová krivka

Obrázok 1 ukazuje príklad grafického stanovenia detekčnej schopnosti ( CC β  ) analytickej metódy. Táto príslušná metóda má zostávajúce riziko podávania falošných rozhodnutí 5% pri koncentrácii 0,50 ug/kg. Pri koncentrácii 0,55 ug/kg riziko podávania falošne zhodných rozhodnutí stúpa na 1%.

3.1.3.3. Reprodukovateľnosť

Určenie reprodukovateľnosti metódy pomocou koncepcie  jednotlivých laboratórnych štúdií   ( vnútrolaboratórna validácia ) vyžaduje opakovanú účasť v skúškach spôsobilosti v súlade s ISO guide 43-1 (3) a 43-2 (4).Laboratóriá si môžu vybrať ich vlastné metódy, tieto metódy sa používajú v rutinných podmienkach. Na vyhodnotenie reprodukovateľnosti sa môže použiť smerodajná odchýlka laboratória.

3.2. Grafická podoba rôznych analytických limitov

Obrázok 2
Látky, pre ktoré nie je ustanovený povolený limit

XS	priemerná hodnota odozvy kontaminovanej vzorky

SB	smerodajná odchýlka slepej vzorky ( determinovaná za podmienok vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti )
SS	smerodajná odchýlka kontaminovanej vzorky ( determinovaná za podmienok vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti )
α	miera falošne nezhodných výsledkov

β	miera falošne zhodných výsledkov

CCα	odozva s udanou α chybou a 50% β chybou

CCβ	odozva s veľmi malou α chybou a β chybou

     

Obrázok 3
Látky s ustanoveným povoleným limitom

XB	priemerná „ koncentrácia „ slepej  vzorky

XPL	priemerná  koncentrácia  vo vzorke obsahujúcej analyt v povolenom limite

XS	priemerná  koncentrácia  kontaminovanej vzorky

SPL	smerodajná odchýlka vzorky obsahujúcej analyt v povolenom limite
 ( determinovaná za podmienok vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti )
SS	smerodajná odchýlka kontaminovanej vzorky
( determinovaná za podmienok vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti )

α	miera falošne nezhodných výsledkov

β	miera falošne zhodných výsledkov

CCα	odozva s udanou α chybou a 50% β chybou

CCβ	odozva s veľmi malou α chybou a β chybou

3.3. Príklad výpočtu pre testovanie robustnosti malých zmien podľa Youden prístupu (16)
Porovnanie priemerov A

AA = ∑(Ai)/4
AB = ∑ (Bi)/4
AC = ∑ (Ci)/4
AD = ∑ (Di)/4
AE = ∑ (Ei)/4
AF = ∑ (Ei)/4
AG = ∑ (Gi)/4
Aa = ∑ (ai)/4
Ab = ∑ (bi)/4
Ac = ∑ (ci)/4
Ad = ∑ (di)/4
Ae = ∑ (ei)/4
Af =  ∑ (fi)/4
Ag = ∑ (gi)/4

Porovnanie priemerov veľkých písmen ( AA do AG ) sw priemermi ich korešpondujúcimi malými písmenami ( Aa do Ag ). Ak má faktor vplyv, rozdiel bude významne väčší než rozdiely ostatných faktorov.
Robustná metóda nemá byť ovplyvnené zmenami stretávajúcimi takmer určite medzi laboratóriami.
Ak nie je významný rozdiel najrealistickejší stupeň náhodných chýb je daný siedmimi rozdielmi.

Rozdiely (Di)

Da = A – a = ∑ (Ai) – ∑ (ai)
Db = B – b = ∑ (Bi) – ∑ (bi)
Dc = C – c = ∑ (Ci) – ∑ (ci)
Dd = D – d = ∑ (Di) – ∑ (di)
De = E – e = ∑ (Ei) – ∑ (ei)
Df = F – f = ∑ (Fi) – ∑ (fi)
Dg = G – g = ∑ (Gi) – ∑ (gi)

Druhá mocnina rozdielov (Di2)

Da2 = hodnota a
Db2 = hodnota b
Dc2 = hodnota c
Dd2 = hodnota d
De2 = hodnota e
Df2 = hodnota f
Dg2 = hodnota g

Smerodajná odchýlka rozdielov Di (SDi):

SDi = √ 2*∑ (D12/7 )

Ak SDi je významne väčšie ako smerodajná odchýlka metódy  uskutočnenej za podmienok vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti podľa ( pozri vyššie ) čo sa dalo vopred očakávať, že všetky faktory spolu majú vplyv na výsledok aj keď každý jednotlivý faktor nevykazuje významný vplyv a metóda nie je dostatočne robustná proti vybraným modifikáciám.

3.4. Príklady výpočtu pre vnútrolaboratórny postup validácie

Príklady a výpočty pre vnútrolaboratórny validačný protokol ako je opísané pod validáciou podľa alternatívnych modelov ( 3.1.3.) (13)(14).

3.5.Príklady pre metódu štandardného prídavku 

Testovaná vzorka s obsahom analytu T je rozdelená na dve skúšobné dávky 1 a 2 alebo hmoty m1 a m2. Skúšobná dávka 2 je obohatená objemom Va roztoku o koncentrácii analytu ρA . Po krokoch purifikácie a extrakcie metódy sa získajú dva extrakty skúšobných vzoriek o príslušných objemoch V1 a V2 . Predpokladaná výťažnosť analytu je rc. Oba analyty sú skúšané metódou merania citlivosti b a dávajú analytickú odozvu x1 a x2.

Ak sa predpokladá, že rc a b sú rovnaké pre analyt v natívnej vzorke a v obohatenej vzorke, potom sa môže obsah T vypočítať ako : 

T = x1.V1.ρ A.VA/(x2.V2.m1- x1.V1.m2)

Metóda dovoľuje určenie výťažnosti. Potom prídavok s vyššie opísaným postupom, časť extraktu dávky testu 1 ( objem V3 ) je obohatená o známe množstvo ρ B .Vb . sa analyzuje. Analytická odozva je x3 a výťažnosť je :
rc = x2.V1.V2. ρB.VB/[x3.V1.V3(T.m2+ ρA.VA) - x2.V2.T.m1(V3-VB)]

Okrem toho je možné vypočítať citlivosť b, ako :

b = x1.V1/rc.T.m1

Boli opísané všetky podmienky použitia a detaily (18)

4. Použité skratky

AAS atómová absorbčná spectrometria
AES atómová  emisná spectrometria
AOAC –I Asociácia oficiálnych analytických chemikov - medzinárodná
B viazaná frakcia(imuno postupy)
CI chemická ionizácia
CRM Certifikovaný referenčný materiál
CV variačný koeficient
2 D  dvojrozmerný
DAD detektor diódového poľa
DPASV diferenčná pulzná anodická strippová voltametria
ECD  detekcia záchytu elektónu
EI elektónová nárazová ionizácia
GC plynová chromatografia
HPLC vysoko účinná kvapalinová chromatografia
HPTLC vysokoúčinná tenkovrstvová chromatografia
HRMS vysoko rozlišovacia ( hmotnostná spektrometria )
ICP-AES atómová emisná spektrometria s indukčne viazanou plazmou
ICP-MS hmotnostná spektrometria s indukčne viazanou plazmou
IR infračervené
ISO Medzinárodná organizácia pre normalizáciu
LC kvapalinová chromatografia
LR(MS) nízko rozlišovacia ( hmotnostná spektrometria )
MRPL  minimum požadovaných pracovných limitov
MS hmotnostná spectrometria
m/z  pomer hmota/náboj
RF relatívna  migrácia k čelu rozpúšťadla (TLC)
RSDL relatívne smerodajné odchýlky laboratória 
SIM selektovaný monitoring iónov
TLC chromatografia na tenkej vrstve
UV ultrafialové svetlo
VIS viditeľné svetlo